【文献分享】CyTOF发现与PDAC转移风险相关的关键细胞亚群
在胰腺导管腺癌（PDAC）的肿瘤微环境（TME）中识别与转移相关的免疫细胞组成将有助于开发有前途和创新的治疗策略。然而，在晚期PDAC的TME中，免疫细胞谱系的动态仍然难以捉摸。
近期，复旦大学附属华山医院董琼珠、钦伦秀团队在Med（IF=17）上发表题为“Single-cell mapping reveals several immune subsets associated with liver metastasis of pancreatic ductal adenocarcinoma”的研究论文。本研究使用CyTOF质谱流式细胞技术描述了具有不同转移进展模式的PDAC患者的局部免疫状态，确定了与肝转移相关的特异性免疫图谱，并通过单细胞测序验证了研究结果。此外，研究还发现，不同免疫组成的分层患者与PDAC的临床结果相关，或将有助于识别可能受益于免疫治疗的候选患者。
其中，CyTOF与单细胞测序的检测分析服务均由普罗亭提供。
▶ CyTOF揭示血液、淋巴结和原发肿瘤存在免疫图谱差异
研究人员对11例不同疾病程度的PDAC患者的原发肿瘤和免疫相关部位（外周血和淋巴结）中分离出来的单细胞悬液进行了CyTOF分析，全面解析了免疫图谱。
结果发现，肿瘤中CD4+和CD8+ T细胞的平均频率明显高于血液中，血液中粒细胞的频率高于肿瘤组织和淋巴结，而淋巴结中CD4+ T细胞和B淋巴细胞的比例则高于血液和肿瘤组织。而在所有PDAC患者的淋巴结和肿瘤组织中，NK细胞的比例显著降低；在所有患者的淋巴结中粒细胞和单核吞噬细胞的百分比均显著降低。
随后研究者还根据CyTOF检测结果分析了免疫细胞功能分子和转录因子在肿瘤环境中的表达模式，结果再次表明在血液、淋巴结和原发肿瘤的亚群组成中可能存在主要的免疫谱系差异。
▶ CyTOF揭示不同分期PDAC中免疫细胞的异质性，诊断为LM的PDAC中CD103+PD-1+CD39+CD4+ T细胞的比例急剧下降
为充分捕捉11例PDAC患者原发肿瘤中免疫细胞的异质性，研究人员对CyTOF数据进行了深度挖掘分析，并鉴定出38种细胞类型，并确定了每个患者T细胞相对于亲本群体的频率和表型。
结果显示了晚期PDAC中CD103+PD-1+T细胞亚群的独特分布。在CD4+ T细胞亚群中，LA组和LM组中CD103+PD-1+细胞的百分比均显著低于BR组。基于这一亚群，LA组和LM组中CD103+PD-1+CD13+CD39+CD4+T细胞的比例均显著降低。此外，与BR组相比，LM组的CD103+PD-1+CD39+CD8+ T细胞在整个细胞群中的比例显著降低。
研究人员使用mfIHC量化CyTOF检测的免疫细胞亚群分布，结果一致。这些数据强调了PDAC中高度异质性的免疫浸润，与其临床表型相关。
▶ CyTOF发现CD73+CD36+CD49f+巨噬细胞亚群可能在PDAC的转移前生态位形成中发挥重要作用
研究中发现，巨噬细胞的百分比高于除T细胞外的其他免疫细胞，因此研究人员关注了三种临床分期的PDAC患者原发肿瘤中的巨噬细胞动力学。
使用33个marker对肿瘤中的巨噬细胞进行CyTOF检测，结果发现，LM组的CD73+巨噬细胞数量高于其他两组。进一步的分析显示，LM组中CD73+CD36+CD49f+巨噬细胞亚群显著高于BR组和LA组，而CD73+CD169+ CD206+CD204+巨噬细胞亚群的比例显著高于BR组，与LA组相比没有显著差异。mfIHC结果与上述结果一致。
这些观察结果表明，特定的巨噬细胞亚群可能在PDAC的转移前生态位形成中发挥重要作用。
▶ scRNA-seq验证CyTOF结果，将关键免疫细胞亚群与PDAC转移相关联
为验证CyTOF结果，研究人员使用公共scRNA-seq数据分析了17个PDAC样本，并聚类出16个亚型。将细胞和样本分为转移性和非转移性进行比较，发现转移组中腺泡细胞、单核细胞、内皮细胞、上皮细胞和NKs的富集。肥大细胞、T细胞、浆细胞、B细胞、树突状细胞和周细胞在非转移组中更为普遍。
根据scRNA-seq数据中的绝对细胞数量来匹配从CyTOF中识别出的细胞亚型，研究人员发现，在CD4+ T细胞群中，非转移组中的CD103+PD-1+（双阳性）和CD103+PD-1+CD39+（三阳性）T细胞的频率增加，无论是在所有细胞还是仅T细胞亚群中。另一个scRNA-seq数据的结果则显示在原发肿瘤中，CD103+PD-1+ CD39+CD4+ T细胞的比例在所有细胞和T细胞亚群中较高。
研究人员另外分析了另一组健康个体和肿瘤患者的scRNA-seq数据，发现原发肿瘤中CD103+PD-1+CD39+CD4+ T细胞的比例均高于健康患者或PDAC患者的血液样本。TIGIT是PDAC中一种新发现的免疫检查点受体。研究人员量化了这个公共队列中CD4+ T细胞中TIGIT的分布，发现与对照组胰腺相比，肿瘤中TIGIT+CD4+ T细胞的比例更高。
此外，在转移组中，CD73+、CD73+ CD36+和CD73+CD36+CD49f+巨噬细胞的频率更高。
▶ 转录组研究解析不同免疫细胞亚群间的相互调节作用
通过比较三阳性T细胞与其他T细胞，研究人员确定了在这些三阳性T细胞中表达的特异性标记物，并定量评估了双阳性和三阳性T细胞的功能状态，并在这些亚群中观察到更高的细胞毒性和衰竭评分。双阳性和三阳性的CD4+ T细胞，显示出显著更高的细胞毒性评分；双阳性和三阳性CD4+ T细胞以及CD8+ T细胞均显示出耗尽分数显著增加。
对巨噬细胞进行类似分析，发现CD73+CD36+CD49f+巨噬细胞倾向于m2样状态，促进抗炎反应和免疫抑制微环境。
细胞通讯分析结果显示，在双阳性T细胞和CD73+巨噬细胞之间观察到一些特定的配体-受体相互作用。这些配体-受体对的特异性富集为靶向治疗和预防PDAC转移提供了线索。
▶ CyTOF发现的关键免疫亚群可作为PDAC预后评估的参考指标
最后，研究人员通过mfIHC将CyTOF发现的关键免疫细胞亚群和PDAC临床特征进行关联，并确定了转移和免疫细胞质检的关系。mfIHC数据显示，转移患者CD4+ T双阳性免疫细胞浸润明显减少，而CD73+巨噬细胞密度较高。
基于上述发现，研究人员评估了双阳性CD4+ T细胞或CD73+巨噬细胞对PDAC患者的预后价值。Kaplan-Meier分析显示，CD4+ T细胞双阳性率高的患者的总生存率显著高于CD4+ T细胞双阳性率低的患者。相反，CD73+巨噬细胞高浸润的患者预后则较差。多变量分析则显示双阳性CD4+ T细胞或CD73+巨噬细胞的存在是生存的独立预后因素。
【文章总结】
本文以CyTOF技术为核心，对比分析了不同阶段PDAC患者的肿瘤、血液及淋巴结中的免疫细胞，并发现了与PDAC肝转移相关的关键细胞亚群。公共scRNA-seq数据的分析结果和mfIHC结果验证了CyTOF的重要发现，进一步挖掘了免疫细胞间的通讯关系，为PDAC LM的潜在治疗靶点提供线索，并确立了两种亚群其作为独立预后因素的价值。
参考文献
Zhang Z, Zhu XQ, Yang F, Lai NN, Zhu L, Cole K, Hu BY, Li TE, Zhu Y, Zhang LM, Wang S, Zheng Y, Mao H, Zhao Y, Bruns C, Vago R, Tu B, Wong JWH, Fu DL, Qin LX, Dong QZ. Single-cell mapping reveals several immune subsets associated with liver metastasis of pancreatic ductal adenocarcinoma. Med. 2023 Aug 16:S2666-6340(23)00233-7. doi: 10.1016/j.medj.2023.07.010. Epub ahead of print. PMID: 37633269.
