【文献分享】CyTOF构建人乳腺癌肿瘤及免疫生态系统图谱
近年来，乳腺癌发病率逐年攀升，让众多女性“闻之色变”，根据2020年世界卫生组织国际癌症研究机构（IARC）发布的数据，乳腺癌已成为全球第一大恶性肿瘤，是女性最常见的恶性肿瘤之一。对乳腺癌生态系统的了解是实施精准医学的基础，CyTOF质谱流式细胞技术通过分析患者的整个肿瘤生态系统，为临床建立患者分类和提供精准治疗提供理论基础。
单细胞基因组和转录组为乳腺癌的分析提供了肿瘤内基因组多样性和肿瘤间克隆组成差异的见解，但分析的细胞和肿瘤很少。鉴于乳腺癌细胞表型和细胞关系的异质性，患者分类和治疗应考虑整个肿瘤生态系统。
基于上述背景，苏黎世大学Johanna Wagner教授课研究团队使用了CyTOF对对144个肿瘤样本和55个非肿瘤样本进行了检测，并在《Cell》（IF=64.5）上发表了研究成果，文章题为“A Single-Cell Atlas of the Tumor and Immune Ecosystem of Human Breast Cancer“ 。CyTOF质谱流式细胞技术揭示了乳腺上皮细胞和免疫细胞的巨大表型多样性、肿瘤细胞的表型异常和肿瘤个体性，并突出了同型和异型肿瘤-免疫细胞关系，实现了基于肿瘤生态系统的患者分类。
▶ 研究方法
CyTOF分析144个肿瘤样本和55个非肿瘤样本
▶ 关键发现
1）CyTOF揭示乳腺癌生态系统的单细胞蛋白质图谱及免疫状况
CyTOF对1600+万个单细胞进行检测，比较肿瘤和非肿瘤组织之间的细胞亚群出现的频率，与非肿瘤组织相比，乳腺肿瘤富含上皮细胞，并且含有更少的内皮细胞和成纤维细胞。FAP+SMA+成纤维细胞在肿瘤组织中比在非肿瘤组织中更丰富。此外，细胞亚群出现频率在肿瘤亚型之间也有所不同，在 TN和HER2 +中观察到的免疫细胞频率高于其他乳腺癌类型。
进一步分析发现乳腺肿瘤组织富含T细胞和B细胞，与肿瘤旁组织相比，含有较低频率的NK细胞和粒细胞。T细胞和巨噬细胞可以发挥促肿瘤或抗肿瘤活性，通过 对T细胞的深入分析确定了十个 CD4 +和十个 CD8 + T 细胞亚群（T01-T20）。大多数T细胞亚群具有效应记忆表型（CD197low, CD45RAlow），肿瘤相关T细胞作为表型连续体存在于CD4 +和CD8+谱系中。CD4+ T细胞中 PD-1的平均表达水平高于CD8+T 细胞。
此外，研究者观察到ER-和ER+肿瘤T细胞状况的差异及不同的 PD-1+表型的富集情况，ER-疾病中出现更高频率的 T-regs，PD-1highCTLA-4 + CD38 +T 细胞在ER -肿瘤中更常见，而 PD-1int CTLA-4 - CD38 - T 细胞（T14）在ER +肿瘤中富集。
2）CyTOF发现乳腺肿瘤组织中富含免疫抑制性巨噬细胞
通过CyTOF分析肿瘤相关巨噬细胞（TAM)，将细胞分为五类 19 个亚群（M01-M19）。与非肿瘤组织相比，肿瘤组织中富含 TAM，缺乏组织驻留巨噬细胞（M08和M09经典循环（M06）和促炎（M15）单核细胞。TAM 的浸润与侵袭性疾病有关。与ER+肿瘤相比， ER-肿瘤包含更高频率的M01和M17 PD-L1+TAM，具有M04、M05、M10 或 M12 表型的巨噬细胞更少。一部分ER+肿瘤具有 M01 和 M02 PD-L1 + TAM，其频率与ER-肿瘤相当或更高。与 Luminal A肿瘤相比，Luminal B肿瘤含有更多具有 M07 或 M17 表型的巨噬细胞，较少具有M04 表型，以及更多的 PD-L1 + TAM。与2级肿瘤相比，PD-L1 + TAM 在3级肿瘤中富集。与低级别肿瘤相比，3级肿瘤包含更少的具有M04或 M05表型的细胞，但更多的经典单核细胞 (M06)。
3）CyTOF发现肿瘤上皮细胞异质性和表型异常
对来自肿瘤和非肿瘤组织的上皮细胞的分析揭示了上皮标志物的双峰和梯度样表达，表明许多不同的细胞表型，根据标记表达将它们分为七个管腔组 L1-L7 和两个基础组B1和B2。
根据谱系标记表达模式鉴定了乳房成形术和非肿瘤组织中的管腔和肌上皮细胞。乳腺上皮细胞系证实了这些模式的可靠性。鉴定了增殖的 (Ki-67 + ) 非肿瘤管腔细胞。大约 55% 的肿瘤衍生细胞是L1和L2组，这表明肿瘤样本中富含分化的正常样管腔细胞。L3-L7 组以肿瘤细胞为主。L3 组表型显示高水平的 EpCAM 和 CD49f 和低 ERα 表达，这是腔内祖细胞的特征。L4 组表型显示出高水平的激素受体ERα、孕酮受体 B (PRB) 和AR，以及受体酪氨酸激酶HER2、EGFR和肝细胞生长因子受体(c-MET)。这些受体与 ERα 或 HER2 的共表达可以赋予抗ERα和抗HER2治疗的抗性。缺乏ERα 和HER2与抗ERα和抗HER2治疗的抗性有关。Ki-67 + luminal 肿瘤细胞在所有 luminal 簇组中均发现，并且在 L7 组中最常见。
此外，L1-L7组表型在肿瘤亚型中的分布不同。与 HER2+和TN肿瘤相比，L1组和L2 组表型指示成熟的管腔细胞和L4组和L5组强烈表达ERα的表型在管腔A和B肿瘤中更常见。增殖组L7表型常见于几个luminal B 肿瘤、几个luminal A肿瘤和一个TN肿瘤。Luminal B-HER2+和HER2+肿瘤含有来自L3和 6 组的细胞。与邻近的非肿瘤组织相比，许多管腔肿瘤含有更少的K7+和更多的K8+和K18 +细胞，表明可能由上调的PI3K和 AKT 信号传导诱导的细胞角蛋白转换。
4）基于CyTOF结果建立肿瘤分层信息及阐明肿瘤与免疫细胞的关系
随后，建立了三个计算分数来量化肿瘤异质性的不同方面。表型异常描述了肿瘤细胞表型偏离非肿瘤上皮细胞的程度。肿瘤个体性根据细胞表型量化肿瘤的相似性。肿瘤丰富度表示生态系统内不同共存肿瘤细胞表型的数量。表型异常细胞在高级别肿瘤、大多数ER -肿瘤、一部分ER+肿瘤和预后不良的亚型肿瘤中富集。肿瘤个体性在高级别肿瘤和luminal B、luminal B-HER2+或TN亚型肿瘤中更为突出。ER+肿瘤的个体差异很大，并且与ERα+细胞的百分比相关，未检测到个体与侵袭淋巴结或远处转移之间的关联。与非肿瘤组织相比，大多数肿瘤的丰富度没有增加，并且肿瘤丰富度与个体性负相关。主成分分析确定了解释不同组之间最高变异性的亚群，临床亚型和分级存在异质性，揭示了肿瘤生态系统中的关系与疾病进展的特征，肿瘤上皮及其免疫环境中的模式都包含肿瘤分层信息。对所有细胞表型的频率进行了成对相关分析，在来自不同亚群的表型之间发现了同型上皮细胞关系。肿瘤相关免疫细胞之间的关系分析，表明了免疫抑制相互作用。
此外，免疫抑制模式与肿瘤表型异常和个体评分、缺氧和增殖相关。免疫抑制性TAM 和 T 细胞与ERα+细胞丰度之间的相关性，表明雌激素信号传导是肿瘤生态系统中的塑造力量。
【文章总结】
本研究通过对来自 144 个肿瘤样本和55个非肿瘤样本的CyTOF检测，构建了一个广泛的人类乳腺癌生态系统单细胞图谱。该图谱揭示了乳腺上皮细胞和免疫细胞的巨大表型多样性、肿瘤细胞的表型异常和肿瘤个体性，并突出了同型和异型肿瘤-免疫细胞关系，实现了基于生态系统的患者分类。乳腺癌生态系统图谱的建立为识别肿瘤生态系统中临床相关的细胞表型及其关系提供了基础，为将来用于患者分层和精准医学应用提供了理论依据。
参考文献
Wagner et al., 2019, Cell 177, 1330–1345
普罗亭
PLTTECH
质谱流式多场景应用开创者
浙江普罗亭健康科技有限公司是一家专注于提供质谱流式免疫图谱精准解决方案的国家高新技术企业。公司致力于质谱流式产品研发、生产、销售及检测服务，产品涵盖质谱流式细胞仪器、相关配套试剂、流式数据分析软件、质谱流式临床及科研检测服务、免疫力评估、数据分析服务等，为用户提供全方位全流程整体解决方案。
普罗亭是质谱流式多场景应用开创者，布局质谱流式全产业链、赋能临床诊疗、医学研发、健康管理，让前沿生物科技普惠大众 。
