【文献解读】单细胞及空间多组学构建完整数据链，揭示胰腺癌免疫功能障碍的机制

胰腺癌PDAC 对免疫治疗具有很强的耐药性，因此迫切需要对PDAC 的免疫微环境有一个更为细致的了解，以探索耐药机制，为治疗提供可靠的信息。

德国海德堡大学的研究团队在《Gastroenterology》上发表题为“Spatially Resolved Multi-Omics Single-Cell Analyses Inform Mechanisms of Immune Dysfunction in Pancreatic Cancer”的文章，采用CyTOF质谱流式技术、单细胞测序技术、mfIHC技术以及空间转录组技术，通过对PDAC 患者的组织和血液样本分析，全面的揭示了 PDAC 中多层次的免疫功能紊乱，充分挖掘了多组学数据在肿瘤微环境研究中的价值。

单细胞及空间多组学深入剖析PDAC的免疫微环境，为 PDAC 的免疫检查点治疗提供指导。

研究提供了PDAC免疫景观的空间分辨精细图。我们证实了CD8 T细胞的耗竭表型和髓系细胞的免疫抑制特性，并强调了在PDAC中可能被低估的免疫亚群，它们不同于邻近正常区域的免疫群体，尤其是CD4 T和NKT细胞。对PDAC和肺腺癌的免疫表型的差异分析显示，在PDAC中存在异常的免疫抑制亚型，以及一个独特的免疫检查点组成。

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构建人胰腺导管腺癌免疫微环境的单细胞图谱

研究人员采用scRNA-seq分析了胰腺癌患者的肿瘤和相匹配的邻近非肿瘤胰腺组织，采用CyTOF分析了患者术前的外周血PBMC以确定免疫表型与预后的关系，采用mfIHC评估了手术切除样本的免疫亚型，并与免疫检查点治疗效果较好的结直肠癌（CRCs）、胃癌和肺癌（LUAD）进行对比分析。

scRNA-seq结果显示，在相邻的正常组织和肿瘤组织之间有12个聚类共享，大多数集群在患者之间共享，但存在大量的异质性。

mfIHC结果显示肿瘤-免疫细胞的相互作用在空间上受到限制，只有成纤维细胞和树突状细胞在肿瘤边界积累。

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CD8 T细胞在PDAC肿瘤微环境中功能失调

肿瘤和相邻的非肿瘤样本中共享的6个定义明确的T细胞亚群。除幼稚的CD8 T细胞和耗尽的CD8 T（CD8 Tex）细胞外，研究人员鉴定了一个CD8组织驻留记忆（CD8 Trm）表型群体和3个CD8 T效应子细胞群（CD8 Teff）注释，如CD8 Teff-GZMK、CD8 Teff-GNLY和CD8 Teff-IFNG。

CD8 Teff-GNLY细胞在Teff簇中表达了相对高水平的细胞毒性模块，在肿瘤浸润性CD8 Teff细胞群中显著下调，表明尽管CD8 Teff细胞存在于PDAC TME中，但它们的细胞毒性潜能可能受损。

mfIHC验证了上述结果，并提供了CD8 T细胞的空间分布，值得注意的是，PRF1+ CD8+T细胞在PDAC TME中几乎不存在，并且倾向于在肿瘤边界和CD163þ巨噬细胞附近略有富集。

随后，研究人员通过CyTOF分析了肿瘤和相应血液中样本中的CD8 T，额外发现2个亚群：效应记忆（CD8 Tem）和中央记忆（CD8 Tcm）细胞簇。Teff和Tem亚群占外周血中CD8 T细胞的大部分，但它们在TME中占<的30%；CD8 Tcm细胞在肿瘤和全身免疫系统中都很少存在；大多数外周血中的T细胞表达高水平的穿孔素，而只有少数细胞在肿瘤中表达穿孔素。

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NKT在PDAC肿瘤微环境中效应分子的表达尤其受损

对NKT亚群的分析结果显示，在邻近的非肿瘤组织中，GZMB、GNLY和PRF1高表达，而在肿瘤部位免疫抑制分子的表达升高。IRF8在非肿瘤区域的NKT细胞中也显著高水平表达，表明TME NKT细胞的功能仍然不成熟。

对外周血的NKT进行对比分析发现，外周内的NKT细胞表现出更强的细胞毒性表型，具有更高的穿孔素表达和更高的细胞毒性活性，而在肿瘤浸润的NKT细胞中几乎完全减弱。此外，PDAC肿瘤浸润NKT表现出异常的耗竭状态，与其他免疫治疗效果良好的癌种相比其效应分子的表达尤其受损。

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肿瘤浸润性CD4 T细胞在胰腺癌中有一种异常的功能失调的表型

对CD4 T细胞的分析鉴定出6个聚类。研究人员从中观测到2种不同的CD4 T耗竭模式：CD4 Tex细胞表达高水平的PDCD1、TIGIT、CTLA4和CXCL13、14，和CD4CD52细胞中度表达多种抑制性受体和高水平的CD52和RORA。

CD4 Tex簇几乎完全来自于肿瘤样本。Treg与CD4 Tact-IFNG细胞和CD4 Tmem细胞一起在肿瘤部位聚集，CD4CD52细胞在相邻非肿瘤区域内相对较丰富。

令人瞩目的是，LUAD中异常免疫调节的CD4CD52 T细胞簇完全缺失，而CD4 Tex细胞相对更丰富。在PDAC中Treg中显示抑制性受体的表达显著升高，而CD4 Tex细胞表达了更高水平的抑制性受体TIGIT。

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胰腺导管腺癌肿瘤微环境中的髓系细胞主要向肿瘤促进亚群倾斜

对髓系细胞的分析在肿瘤与相邻组织中均鉴定出C1Q巨噬细胞、MARCO巨噬细胞、CD14+和CD16+单核细胞。经典的CD14+单核细胞在TME中相对丰富，而C1Q巨噬细胞在邻近正常组织中富集并表达了更高水平的参与抗原呈递和共刺激的基因。主要的PDAC浸润CD14+单核细胞群体表达高水平的参与血管生成和免疫调节的基因，表明它们具有促肿瘤作用，而较少的非经典CD16þ单核细胞表现出促炎表型。

PDAC TME中，C1Q和MARCO巨噬细胞存在的比例相同，其中MARCO巨噬细胞中与免疫抑制细胞类型的募集相关的趋化因子（CCL2，CCL20）的表达显著升高。

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胰腺导管腺癌中的肿瘤浸润性树突状细胞具有功能失调的表型，其交叉表现能力受损

研究人员从肿瘤浸润性树突状细胞中鉴定出2个常规DC群体，其中cDC2是TME中的主要亚型。

从scRNA-seq数据中鉴定出一群活化的树突状细胞，与DC成熟和免疫调节相关，同时表达IDO1、LGALS9、IL6和STAT3，可能会减弱T细胞活化和细胞毒性。另外，鉴定了一组潜在的单核细胞来源的树突状细胞，它们高表达促炎细胞因子，以及一群浆细胞样树突状细胞，它们以高水平的ICOSLG和TGFB1为标志。

与LAUD相比，PDAC中，cDC1表达参与抗原交叉呈递的基因水平显著降低，表达CCL17和IL8升高，可能促进Treg迁移和血管生成。

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空间转录组揭示PDAC空间异质性及细胞间相互作用

空间转录组对不同病理注释区域中免疫细胞亚型的相对比例进行定量分析，显示了患者间深刻的异质性。与所有患者相比，与周围间质相比，肿瘤区域的初始CD8、CD8 Trm、cDC1、cDC2、单核细胞来源的DC、NK细胞和C1Q巨噬细胞以及肥大细胞显著减少。

对细胞间相互作用的进一步研究发现，LAG3与主要组织相容性复合物II类复合物的基因共表达，这表明抗原呈递与免疫检查点共同调控，抑制CD4 T细胞的活化；TIGIT在T和NK细胞上的表达与其配体PVR和PVRL2在髓系和上皮细胞上的表达相关，可能在T和NK细胞中诱导调节性、非细胞毒性谱；HAVCR2/TIM3和LGALS9表达水平存在相关性，在不同的隔室中抑制T细胞激活和细胞毒性。

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胰腺癌患者免疫微环境组成及其与预后的关系

最后，研究人员系统地研究了肿瘤免疫微环境特征与预后间的关联，并发现有两种复合免疫特征可以清楚地将PDAC患者分为预后亚组。CD8 T和CD4 T细胞水平高水平的肿瘤以及选择性激活的巨噬细胞水平低的肿瘤与显著更长的总生存期相关。同样的高丰度的的CD8 T细胞，以及低水平的B细胞和MARCO巨噬细胞，与更好的总生存率显著相关。

参考文献

Yousuf S, Qiu M, Voith von Voithenberg L, Hulkkonen J, Macinkovic I, Schulz AR, Hartmann D, Mueller F, Mijatovic M, Ibberson D, AlHalabi KT, Hetzer J, Anders S, Brüne B, Mei HE, Imbusch CD, Brors B, Heikenwälder M, Gaida MM, Büchler MW, Weigert A, Hackert T, Roth S. Spatially Resolved Multi-Omics Single-Cell Analyses Inform Mechanisms of Immune Dysfunction in Pancreatic Cancer. Gastroenterology. 2023 Oct;165(4):891-908.e14. doi: 10.1053/j.gastro.2023.05.036. Epub 2023 May 30. PMID: 37263303.